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去屑剂吡硫翁锌对抗限制性马拉色菌的作用机理研究

来源:医学护肤品日期:2020-6-26
  核心提示:去屑剂吡硫翁锌对抗限制性马拉色菌的作用机理研究

头皮屑是一种与头皮异常剥落相关的常见头皮疾病。有一半的成年人在生活中的某些时候会受到这种疾病的影响1。通常,头皮屑有三个病因,即马拉色菌、皮脂分泌和个体易感性2。其中,马拉色菌一直被认为是头皮屑的主要原因;使用含抗真菌剂的洗发水治疗后可以减少头皮屑和头皮上的马拉色菌细胞数量3-5,这可以证明上述说法。目前已经鉴定出的马拉色菌属共有17种,其中,限制性马拉色菌(M.stricta)是人类皮肤上的优势菌属6-10。此外,最近的大规模测序分析表明,与健康头皮相比,有头皮屑的头皮上含有更多的限制性马拉色菌,这表明真菌与头皮屑之间存在关联8,11,12。研究表明,马拉色菌分泌的脂肪酶会促进头皮屑的产生,因此,人们推断这些酶会水解皮脂甘油三酯,促进马拉色菌细胞摄取饱和脂肪酸并产生能量。皮肤上累积过量的不饱和脂肪酸(如油酸)将对头皮屑患者产生皮肤刺激性2,13。

吡硫翁锌(ZPT)是吡啶硫酮(1-羟基-2-吡啶硫酮)的衍生物,由黄曲霉(Aspergillusflavus)的抗微生物代谢物“曲霉酸”合成14-17。许多含0.3–2%ZPT的洗发水和洗发产品已被广泛用于治疗头皮屑18。尽管ZPT被广泛用作去屑剂,但其对抗马拉色菌(特别是限制性马拉色菌)的作用机理扔不清楚;现有研究仅报道了对ZPT抑制马拉色菌生长的生理学观察19,20。目前已使用不同的模型真菌(而非限制性马拉色菌)对ZPT的作用机理进行表征。Ermolayeva和Sanders21使用了粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)并认为ZPT直接或间接导致膜去极化,从而抑制了质子泵介导的膜转运。他们认为这种抑制作用可能仅由吡啶硫酮产生,因为锌盐在ZPT转运到细胞质中后会解离,而只有吡啶硫酮能以这种方式发挥作用21,22。但是,只有当吡啶硫酮的浓度明显较高(高于真菌的抑制浓度),才会发生膜去极化23;因此,很难确定ZPT对真菌的作用机制是否与膜去极化有关。

Yasokawa等24分析了用ZPT处理的酿酒酵母细胞转录组,发现ZPT上调了铁转运所需基因的表达。这些结果表明,ZPT在酵母细胞中诱导铁饥饿。此外,他们观察到在含ZPT的培养基中添加铁可以恢复酿酒酵母细胞的生长,从而证实该化合物可以诱导酵母细胞的铁缺乏。相反,由Reeder等25开展的另一项研究表明,经ZPT处理后,酿酒酵母细胞的铁含量未发生改变,但他们观察到Fet3(高亲和性还原铁转运系统的亚铁氧化酶)的表达上调,这提示铁饥饿可能不是ZPT毒性的直接原因。另外,Reeder等25发现,经ZPT处理后,细胞的铜水平升高并且CTR1(细胞膜中的一种高亲和性铜转运蛋白)下调。为了确认细胞铜水平升高是ZPT的生长抑制作用的主要原因之一,研究人员针对ZPT筛选了酿酒酵母单倍体基因缺失文库。经ZPT处理后受到生长抑制的缺失突变体包括缺少ACE1的突变体,其中,ACE1编码一种负责对高细胞铜水平进行解毒的转录因子,这一发现支持ZPT处理导致酵母细胞铜中毒的观点。此外,许多缺失突变体缺乏参与线粒体中铁硫簇(Fe-S)组装的基因,在ZPT处理后,这些缺失突变体表现出显著的生长缺陷。这些结果表明,除了铜中毒之外,铜介导的线粒体内Fe-S簇组装体失活也能促进ZPT的生长抑制作用,至少在酿酒酵母中是如此。

尽管以前的研究提出了ZPT对抗模型真菌的作用机制,但他们尚未明确ZPT抑制马拉色菌生长的作用机理。因此,本研究试图通过生化和转录组分析来说明ZPT对抗限制性马拉色菌的作用机理,并发现ZPT主要引起锌中毒和线粒体功能紊乱。此外,我们的数据表明ZPT可以降低脂肪酶的表达,这对于限制性马拉色菌在头皮屑患者的头皮表面的存活具有重要作用13,26,27。据我们所知,这是第一个直接研究ZPT对抗限制性马拉色菌的作用机理的全面研究。

实验结果总结

 

ZPT处理导致限制性马拉色菌细胞的锌水平升高。
ZPT导致限制性马拉色菌的转录组发生显著变化并且损害线粒体功能。
ZPT改变了限制性马拉色菌中与锌和铜摄取相关的基因表达。
ZPT抑制限制性马拉色菌脂肪酶的表达。

 

讨论


本研究旨在探究ZPT对抗限制性马拉色菌的作用机理,并发现ZPT处理可以显著提高真菌细胞的锌水平,同时小幅提高细胞铜水平。TPEN(一种细胞锌螯合剂)降低了ZPT对限制性马拉色菌的抗真菌活性,而BCS(一种铜螯合剂)却不能降低该活性,这证明了我们的观察结果,即ZPT治疗主要引起细胞锌水平的升高。这些结果与先前对酿酒酵母的研究结果有所不同,后者表明添加BCS可以恢复经ZPT25处理的真菌细胞的生长,并证明ZPT对抗限制性马拉色菌的作用机制与对抗酿酒酵母的作用机制不同。在酿酒酵母中,两种细胞蛋白Ctr1和Ctr3负责高亲和性铜摄取,而Ctr2参与铜通过液泡膜的输出。先前的研究表明,ZPT导致CTR1降低0.08-0.23倍,这解释了添加该化合物后酿酒酵母细胞的铜水平增加。但是,我们发现限制性马拉色菌缺乏酿酒酵母Ctr1和Ctr2的同源物。取而代之的是,限制性马拉色菌可利用单一的铜转运蛋白,即酿酒酵母Ctr3的同源物,转运铜通过细胞膜,这提示该真菌的铜转运系统不同于酿酒酵母。然而,经ZPT处理的限制性马拉色菌中CTR3同源物下调表明细胞铜水平确实略有增加,这意味着铜累积量少量增加可能也有助于ZPT的生长抑制作用。与铜转运系统不同,限制性马拉色菌具有高度保守的真菌锌运输系统。我们注意到,在经ZPT处理的限制性马拉色菌细胞中,酿酒酵母液泡锌转运蛋白Zrc1和Cot1的同源物的表达显著上调,表明真菌中细胞锌水平的增加。

我们的转录组分析表明,ZPT抑制了限制性马拉色菌的Fe-S簇合成,这一结果与使用经ZPT处理的酿酒酵母细胞所获得的结果相似24,25。Fe-S簇合成是在线粒体中发生的主要铁代谢过程之一,经ZPT处理后细胞锌水平升高可能是抑制限制性马拉色菌的Fe-S簇合成的主要原因。尽管变化很小,但细胞铜水平的少量增加也可能有助于抑制经ZPT处理的限制性马拉色菌细胞中的Fe-S簇合成。先前的一些研究表明,细胞锌的过度积累会导致线粒体功能紊乱,这与细胞器中活性氧的积累有关,这种积累会干扰糖酵解、三羧酸循环和电子传递链,从而导致ATP产量降低37-39。我们的数据表明,与线粒体功能(包括TCA循环和电子传递链的活性)相关的许多基因存在差异表达,并且经ZPT处理的限制性马拉色菌的乌头酸酶活性显著降低。通常,在缺乏Fe-S簇合成的真菌菌株中,负责细胞膜中铁摄取的基因的表达增加,以补偿铁代谢的不足40-42。经ZPT处理的酿酒酵母细胞还表现出FET3表达增加,这是细胞膜中高亲和性还原铁摄取系统的一个组分。有趣的是,我们发现该系统的一些成分(如铁通透酶和亚铁氧化酶)已在酿酒酵母、白色念珠菌、新型隐球菌和烟曲霉等其他真菌中被鉴定,而这些成分在限制性马拉色菌的基因组中大量缺失。但是,我们发现限制性马拉色菌具有铁载体合成所需的基因,并观察到MRES_12755(一种烟曲霉SIDA同源物,编码铁载体合成途径中的1-鸟氨酸N5-氧化酶43)以剂量依赖性方式上调,这支持我们的假设:ZPT处理显著干扰了限制性马拉色菌中的Fe-S簇合成。

我们的研究表明,使用ZPT处理限制性马拉色菌可能直接或间接抑制SOD2(编码锰依赖性线粒体超氧化物歧化酶的基因)的表达。在经ZPT处理的限制性马拉色菌中,SOD2基因的表达是下调幅度最大的,我们根据这一发现推测Sod2显著下调可能促进了真菌中Fe-S簇合成减少以及乌头酸酶活性降低。我们之所以提出这一假设,是因为许多研究表明,在缺乏SOD2的突变体中,线粒体活性氧类增加,而SOD2突变体对氧化应激变得高度敏感44-46。然而,ZPT导致SOD2下调的机制尚不清楚。但是,其他真菌中细胞锌中毒与血红素合成之间的联系可能解释了这种现象。在烟曲霉中,锌中毒导致血红素生成减少47,而血红素合成缺乏使酿酒酵母中SOD2的转录水平显著降低28。因此,我们推测ZPT可以增加细胞锌中毒,这降低了血红素合成,进而降低了经ZPT处理的限制性马拉色菌细胞中的SOD2转录水平。尽管仍需进一步研究来验证该假设,但我们认为ZPT引起的细胞锌水平升高导致SOD的显著下调,从而破坏了限制性马拉色菌的Fe-S簇合成并导致线粒体功能紊乱。

最近一项基因组分析表明,几乎所有马拉色菌属(包括限制性马拉色菌)的基因组中都缺乏脂肪酸合成酶基因。但是,它们具有许多编码脂肪酶的基因,这些脂肪酶将来自于宿主皮肤皮脂的脂肪酸作为营养来源48–50。在马拉色菌分泌的脂肪酶水解皮脂中的外源性脂质后,游离脂肪酸(FFA)将被释放并转运至真菌细胞中,这表明脂肪酶在真菌的生理过程中起着至关重要的作用。皮肤表面的这些脂肪酶使FFA水平增加,导致表皮角质形成细胞功能异常,从而产生皮肤刺激性13,51,52。此外,油酸(由马拉色菌的细胞外脂肪酶生成的一种FFA)已被证明可在易感受试者中诱导头皮剥落和皮肤刺激性2。以前,我们在限制性马拉色菌的基因组中鉴定出12种脂肪酶编码基因,并发现在这些基因中,头皮屑患者头皮表面表达最多的是MRES_03670(MrLIP5),这表明这种脂肪酶对于真菌-宿主相互作用的重要性。本研究表明,ZPT处理能够以剂量依赖性方式下调12种脂肪酶基因中的4种(MRES_03205[MrLIP1],MRES_03670[MrLIP5],MRES_04670[MrLIP3]和MRES_16530),这表明ZPT抑制脂肪酶表达是其抑制限制性马拉色菌的主要作用机制之一。Westernblot分析证实了我们在转录组分析中观察到的脂肪酶基因下调,这代表相应脂肪酶的水平降低。在其他几种限制性马拉色菌的临床分离株中,也观察到了ZPT处理导致的脂肪酶表达降低,这表明脂肪酶表达抑制是ZPT对抗限制性马拉色菌的常见机制。我们应该注意到,ZPT对MrLIP5的下调尤为重要,因为其对应的蛋白质可能参与了皮肤表面发病机制26。但是,仍然需要确定经ZPT处理后抑制脂肪酶表达的上游调节因子。综上所述,我们的研究结果表明,ZPT对抗限制性马拉色菌的作用至少与三种抑制机制有关:(1)提高细胞锌水平,(2)抑制线粒体功能,以及(3)降低脂肪酶表达。

 

 

 


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