六味五灵片主要药效测试

核心提示: 六味五灵片主要药效测试方法与结果 :六味五灵片可使鸭乙型炎病毒感染的鸭血清中鸭乙型炎病毒 DNA ( DHBVNA )水平下隆。并且,随着给药剂量增加和时间推移,对乙肝病毒抑制作用增强,呈现一定剂量和时间依赖性。停药后,没有出现由于病毒再复制而产生的“反跳”现象

六味五灵片主要药效测试方法与结果 
 
•  六味五灵片的降酶实验
1  对四氯化碳致大鼠慢性损伤的影响 [1] ;取 istar 大鼠,按体重随机分为 6 组,每组 10 只,正常对照组、肝损伤模型组、护肝片组、六味五灵片高、中、低( 4 、 2 、 1g 生物药 /kg )三个剂量组。除正常对照组外。各组动物腹腔注射( ip ) 30% 四氯化碳( CCl4 )植物油 0.2ml/ 100g 体重,每周两次,共七周,正常对照组 ig 同体积的盐水。造模同时每日灌胃( ig )给药一次( 1ml/ 100g )体重,正常对照组 ig 同体积的蒸馏水,连续给药 7 周。实验结束前,动物禁食 12 小时,将动物摘球采血,以 3000 转 / 分离心 10 分钟,分离血清,测定大鼠血清谷丙转氨酶( ALT )、谷草转氨酶( AST )、总蛋白( TP )、白蛋白( ALB ),采血后将动物处死,取肝组织作羟脯氨酸测定,计算肝胶原蛋白含量 [2] (结果见 1 、 2 )。同时取一部分肝组织,做组织化学及组织病理学检查(结果见附件 1 、照片 1 )。

表 1 六味五灵片对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的影响( n=10 )

组别 剂量 肝功能( X ± SD )
g/kg
 ALT
(чmol/s)/L  ALT
(чmol/s)/L  TP
(чmol/s)/L  ALB
(g/dL)  白/球
(g/dL) 
对照组  268.00 ± 20.86 634.80 ± 22.51  69.50 ± 4.56 40.60 ± 3.45 1.06 
模型组  797.60 ± 32.29 1458.0 ± 27.75 59.50 ± 5.60 30.60 ± 4.40 1.41 
护肝片  0.4 507.60 ± 25.36 935.20 ± 25.21 67.50 ± 10.20 36.20 ± 2.48 1.16 
六味五灵片 4 464.40 ± 23.90 832.00 ± 34.08 65.89 ± 5.05 37.20 ± 3.26 1.30 
 2  2540.80 ± 32.65 860.86 ± 26.71 65.10 ± 4.87 35.20 ± 2.21 1.17 
 1 528.00 ± 21.92 959.20 ± 28.48 60.80 ± 6.29  34.30 ± 2.01  1.30

与正常组比较 #p<0.05##p<0.01 以下均同:与模型组比较 *p<0.05**p<0.01

表 2. 六味五灵片对大鼠肝胶原蛋白含量的影响( X ± SD )

组别 剂量 动物数 胶原蛋白
g/kg
 (只) (ч g/mg 干肝)
对照组  10 22.99 ± 7.21
模型组  10 53.50 ± 11.77
护肝片  0.4 10 40.73 ± 15.43 
六味五灵片 4 10 39.58 ± 16.11
 2  10 36.58 ± 14.07
 1 10 42.50 ± 10.59

与模型组相比, *p<0.05 **p<0.01

表 1 、 2 结果表明六味五灵片可抑制多次注射四氯化碳( CCI 4 )引起的大鼠血清转氨酶的升高、总蛋白( TP )和白蛋白( ALB )降低,减少肝胶原蛋白含量。

2 .对 D ——半乳糖胺所致小鼠急性肝损伤的影响 [3] 取健康小鼠 60 只随机分为六组,即正常对照组、 D- 半乳糖胺( D-GaIN ) 650mg/kg 模型组、护肝片组、六味五灵片( 8 、 4 、 2g /kg )三个剂量组,每组 10 只。每日灌胃( ig )给药,连续四次,对照组及模型组给与相同容积的蒸馏水,末次药后一小时,除正常对照组外,小鼠腹腔注射( ip )半乳糖胺 0.2ml/ 只,造模后 20 小时,小鼠眶静脉采血,测血清谷丙转氨酶( ALT )、谷草转氨酶( AST )值(表 3 ),并取肝组织作病理学检查(结果见附件 2 、照片 2 )。

表 3. 六味五灵片对 D-GaIN 致小鼠急性肝损伤的影响( X ± SD )

组别 剂量 动物数 ALT ALT
g/kg
 (只) (ч mol/s )/L (ч mol/s )/L
对照组  10 245.60 ± 7.93  664.40 ± 24.35
模型组  10 668.80 ± 21.01 1262.4 ± 53.61
护肝片  0.8 10 338.00 ± 17.80 803.20 ± 36.36
六味五灵片 8  10 331.60 ± 24.04 820.80 ± 26.67
 4 10 400.80 ± 27.04 829.60 ± 33.38
 2 10 468.4 ± 28.23  949.60 ± 27.62 

与模型组相比, *p<0.05 **p<0.01

表 10. 六味五灵片在鸭体内对鸭乙型肝炎病毒 DHBV-DNA 的影响

组别 剂量 动物数 DHBV-DNA 水平
g/kg
 ( 只 ) L T 均数 T P
对照组  6 0.42 ± 0.11  0.42 ± 0.13  0.44 ± 0.12  0.42 ± 0.11
模型组  6 0.35 ± 0.15 0.26 ± 0.00  0.25 ± 0.07 0.22 ± 0.07
六味五灵片 4.2 6 0.41 ± 0.14  0.30 ± 0.09  0.26 ± 0.10 0.25 ± 0.09
 22  6 0.46 ± 0.09 0.41 ± 0.08 0.38 ± 0.09 0.34 ± 0.11
 11 6 0.44 ± 0.13  0.40 ± 0.13 0.39 ± 0.16 0.37 ± 0.15
无环鸟苷 5.5 6 6 0.51 ± 0.14 0.27 ± 0.12 0.15 ± 0.05 0.33 ± 0.13

给药组各时相 (T o ,T 5 ,T 10 ,P 3 )DHBV DNAOD 值与病毒对照组各时相 DHBV-DNAOD 值比较, **P<0.01 *P<0.05

结果见表 10 ,六味五灵片可使鸭乙型肝炎病毒感染的鸭血清中鸭乙型肝炎病毒 DNA ( DHBVNA )水平下隆。并且,随着给药剂量增加和时间推移,对乙肝病毒抑制作用增强,呈现一定剂量和时间依赖性。停药后,没有出现由于病毒再复制而产生的“反跳”现象。

2 .在 2.2.15 细胞内对乙型肝炎病毒表面抗原、 e 抗原的抑制作用 [11] 药物六味五灵片用培养基配制成含生药 16g /L 溶液,以 2 倍稀释至 8 、 4 、 2 、 1 、 0.5\0.25mg/ml 加入 96 孔细胞培养板,每浓度 4 孔,每 4 天换同浓度药液,设无药细胞对照组,以观察细胞病变为指标, 8 天显微镜下观察细胞病变,完全破坏为 4 ; 75% 为 3 ; 50% 为 2 ; 25% 为 1 ;无病变为 0 。计算每浓度药液平均细胞病变程度和抑制百分率。按 Reed Meuench 法计算 50% 毒性浓度( TC 50 ),无毒浓度( TC 0 ),见表 11 。

50—50% 抑制百分率


A=log.50% 抑制百分率 B=log<50% 药物浓度 C=log 稀释倍数


表 11 六味五灵片对 2.215 细胞的毒性作用

药物浓度 细胞病变 破坏百分率 % TC50 ( mg/ml )  TC0 ( mg/ml ) 
16 4 4 4 4  100 9.18 4
8 2 2 1 1 37.5
4 0 0 0 0  0
2 0 0 0 0  0
1 0 0 0 0  0
0.5 0 0 0 0  0

表 11 表明 ,六味五灵片对 2.2.15 细胞产生 50% 毒性浓度( TC50 )为 9.18mg/ml ,无毒性浓度( TC0 )为 4mg/ml ,提示六味五灵片对 2.2.15 细胞的药效浓度应选择 4mg/ml ,并在此浓度以下 2 倍稀试验药液。

以每毫升 10 个 2.2.15 细胞接种 24 孔培养板,每孔 lml , 37 ℃ 5%CO 2 培养 24 小时,加无毒浓度以下 2 倍稀释度验药液, 5 个稀释度分别为 4 、 2 、 1 、 0.5\0.25mg/ml, 每浓度 3 孔, 37 ℃ 5%CO 2 培养,每 4 天换的浓度药液培养,第 8 天收集培养液, -20 ℃ 冰冻保存。参照固相放射免疫测定盒说明书测定,用γ计数仪测定每孔 cnm 值,实验设 Hbsag 、 HbeAg 阳性和阴性对照。见表 12 、 13

表 12 六味五灵片在 2.2.15 细胞中第 8 天对表面抗原的影响

药物浓度 mg/ml Cpm(X ± S) 抑制率 % P/N 5  IC50 ( mg/ml ) 
4 1887 ± 127 31.5  12.94  3.33 
2 2058 ± 245*  24.6  14.41  
1 2211 ± 354  18.3  15.24   
0.5 2363 ± 239 12.1  16.32  
0.25 2528 ± 174  5.4  17.49  
细胞对照  2661 ± 279     
阳性对照
 23951       
阴性对照
 203       
空白对照  62       

与细胞对照相比, **P<0.01 *P<0.05

结果见表 12 、 13 ,六味五灵片在无细胞毒性浓度范围内,随着六味五灵片药液浓度增中,对表面抗原( HBsAg )、 e 抗原( HBeAg )的抑制程度亦增加,提示六味五灵片对 2.2.15 细胞 HBeAg 、 HBeAg 具有一定抑制作用并呈剂量依赖性。

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